PMC (日本語)

TEXT

ナタリズマブは、再発性多発性硬化症（MS）を治療するために使用される抗体であり、血液脳関門（BBB）を介して自己反応性リンパ球を含む活性化リンパ球の人身売買を防止する。 ナタリズマブの主な副作用は、進行性多巣性白質脳症（PML）、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイト（1、2）におけるヒトJCポリオーマウイルス（JCV）の複製によって引き起こされる壊滅的な脱髄疾患である。, 血液から中枢神経系（CNS）へのエフェクターt細胞輸送のナタリズマブ阻害は、局所JCV複製を好むかもしれない（3-7）。ここでは、ｅｘ ｖｉｖｏで一晩抗原活性化した後のＭＳ患者の血液中のＪＣＶ特異的エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）の存在を調べた。 In vivoでは、特定のTEM番号は、同族抗原がクリアされると（8-10）低下し、それらの存在は、したがって、進行中のJCV複製を指すことができます。 TEMは、抗原に再曝露すると、ガンマインターフェロン（IFN-γ）などのサイトカインを迅速に放出する。, 以前の酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ELISPOT）は、最大14日間JCVペプチドによる長期活性化後のT細胞におけるIFN-γ発現を調べた（11）。 しかしながら、長期の活性化は、長期の静止Ｔ細胞記憶を再活性化し、拡大することを可能にし、陽性応答が必ずしも進行中の免疫応答を意味するとは限らないことを意味する。 ここでは、最初にPMLを開発した二つのMS患者におけるJCV特異的TEMの存在を検討しました。 最初の患者は、ナタリズマブ（39注入）（神経科、Pitié-Salpétrière病院）で39ヶ月後にPMLと診断されました。, 彼女は39歳で、ナタリズマブの前に、彼女はシクロホスファミドとミトキサントロンを受けていた再発寛解MSの10年の歴史を持っていました。 髄液（ＣＳＦ）についてＭＲＩおよびＪＣＶ ＰＣＲによりＰＭＬを確認した。 JCV特異的TEMについて試験したところ、PML症状発症から8週間後、彼女はCSFのml当たり1,040JCVゲノムコピーを有していた（JCV Q-PCR Alert kit;Nanogen Advanced Diagnostics）。 彼女の末梢血単核細胞（PBMC）は、精製されたJCV（株MAD-4;LGC Promochem;104.5 50％組織培養感染用量/0.2ml）と16時間のAIM-VおよびAlbumax培地（Invitrogen）でin vitroで活性化された。, 組換えインターロイキン2(IL-2)は添加されなかった。 各ウェルに5,534PFUに相当する量のウイルスを添加した。 これは0.02の感染の多重度（MOI）に対応していた。 次いで、細胞を細胞内ＩＦＮ-γについてフローサイトメトリーによって試験した。 一晩活性化後の細胞死亡率は5％未満であった。 に示すようにする。 1AとandB、B、応答細胞は、CD4とCD8T細胞サブセットの両方で検出され、それらのほとんどは、CCR7-CD45RA−メモリエフェクター（12）の表現型の特性を持って, 抗JCV TEMはまた、IFN-γ ELISPOT（捕捉および検出抗体、クローン1-D1およびK7-B6-1、それぞれ；Mabtech）によって、精製されたJCVまたはVP-1ペプチド（JCV VP-1タンパク質全体を覆う14プールの重なり合う15-アミノ酸ペプチドの混合物）によって16時間の活性化に続いて検出された（Fig。 第1回）を開催した。 第二の患者は46歳であり、ナタリズマブの前に、彼女はベータインターフェロン、酢酸グラチラマー、アザチオプリン、およびミトキサントロンを受けていた再発寛解MSの11年の歴史を持っていました。 彼女は24ナタリズマブ注入後に再評価のためのテノン病院MSセンターに紹介されました。, 2012年に行われた脳MRIでは、隣接する皮質右前頭領域に小さな線形のT2高インテンス疑いのある病変が検出されました。 最初のＣＳＦサンプルはＪＣＶ陰性であった。 ナタリズマブ離脱後の繰り返しＭＲＩでは病変サイズの増加が認められ，ＣＳＦ検査ではＪＣＶ陰性であった。 血漿に対するJCV PCRは、PMLの発症後2および4ヶ月後に行われた。 両血しょう試料は陰性であった。 2012年に行われた脳生検では、最終的にPMLの診断が確認されました。,

最後のナタリズマブ注入の2日後に行われたJCVに対するIFN-γ応答のELISPOT分析は、血液中のJCV特異的TEMの存在を示した（図。 第1回）を開催した。 興味深いことに、循環ＪＣＶ特異的ＴＥＭ数は、ＣＳＦ上のＪＣＶ ＰＣＲが第一患者で陽性であり、第二患者で陰性であったため、脳におけるＪＣＶ複製のより高いレベルを有している可能性がある最初のＰＭＬ患者よりも低かった。,

我々はまた、ヨーロッパのマーケティング用語に従ってナタリズマブで治療再発寛解MSと62MS患者のシリーズだけでなく、任意の疾患修飾療法を受けていなかった35MS患者、およびMS患者と年齢と性別に一致した40健康なドナーのグループでELISPOTによってJCV特異的TEMの存在を調べた。 MS患者の特徴を表1に示す。 患者と健康なドナーは、パリのPitié-Salpêtrière病院の倫理委員会によって承認された研究に参加するための書面による同意を与えました。, ELISPOT応答は、補正されたスポット数（活性化されたウェルのスポット数から未処理のウェルのスポット数を差し引いた数）が少なくとも10であり、未処理のウェルでは10スポット未満であれば陽性であると考えられた。

陽性サンプルの割合は、健康なドナーで2.5％であった（Fig. 2A）。 MS群では、陽性患者の割合は、ナタリズマブの時間とともに上昇した（Fig. 2BおよびandC)、C)、未治療のMS患者では8.8％から15.9％まで、ナタリズマブで24ヶ月未満で治療された患者では27％、24ヶ月以上治療された患者では27％まで（Fig., 2C）（未治療のMSおよび対照被験者に対して24ヶ月以上の治療を受けた患者にとって有意である）。 ＪＣＶ ＴＥＭ応答の検出頻度のこの増加は、長期のナタリズマブ治療がＪＣＶ再活性化を支持することを示唆した。

ナタリズマブ治療患者のサブセットを少なくとも二度サンプリングした表1参照。 に示すようにする。 2D、これらの患者さんのいずれかになったの影の中のサンプリング期間です。,

腎臓はJCVの主要な貯蔵所である。 一般集団のかなりの割合が尿中にウイルスを排泄するが、血液中にJCVの証拠はない（13-15）。 さらに、脳におけるJCV DNAの存在は、腎臓におけるその存在とは無関係であるように見える（16）。 に示すようにする。 2E、血液中の検出可能なJCV TEMを有するMS患者の60％は、尿中に検出可能なJCVを有さず、尿中の陽性JCV PCRを有する患者の69％は、検出可能なJCV TEMを有さなかった。 検出可能なJCV TEMを含まないJCV尿中排excretionも健康なドナーで観察された（Fig. 2E）。, これは、腎臓におけるＪＣＶ複製の存在が、必ずしも血液中に検出可能なＪＣＶ ＴＥＭをもたらすとは限らないことを示唆している。 逆に、これは、血液中のJCV TEM検出が進行中の腎外JCV複製を反映している可能性を高める。

新規JCV酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）法（17）を用いた研究では、ナタリズマブで治療されたMS患者におけるJCVの推定血清前価は53.6％（17）であった。 血清陽性は、必ずしもウイルスの再活性化に関連するTEM応答の存在と相関しない。, 長命形質細胞は、おそらく何十年もの間、長期間骨髄に持続し、活性病原体の複製なしに持続的な血清抗体価を維持することができる（18、19）。 同じELISA法を使用して、JCV ELISPOTによってテストされたナタリズマブ治療MS患者の56をテストし、2PML患者を含みました。 に示すようにする。 2F、患者の53.6％が血清陽性であり、16.1％がELISPOT陽性であった。 ＪＣＶ血清陽性患者の二十七パーセントは、血液中に検出可能なＪＣＶ ＴＥＭを有していた。 ＪＣＶ ＥＬＩＳＰＯＴ陽性の患者は血清陰性であった。, Gorelikらによると。、JCV血清学的検定の偽陰性率は2.5％である（17）。

我々の結果は、MS患者におけるJCV TEM応答の検出頻度がナタリズマブの時間とともに増加することを示している。 以前の研究では、ナタリズマブ療法の12ヶ月後にJCVに対するT細胞応答の増加も示したが、この研究は治療の18ヶ月（20）に限定されていたが、エフェクターt細胞応答の最も強い増加は24ヶ月後に起こったことがわかった。,

したがって、我々の結果は、腎外部位を含むナタリズマブ治療中のJCV再活性化を指している。 JCVは、PML（なしHIV血清陰性個体の脳内で検出されている21）。 ナタリズマブによって誘発されるCNS免疫抑制の減少は、無症候性の間欠的ウイルス複製として始まるかもしれないが、持続的なウイルス複製に向かって、その後PMLに進化する可能性がある局所ウイルス再活性化を好むかもしれない。 ウイルスの再活性化は、脳排出頚部リンパ節（22-24）などの場所で、抗原提示細胞を介して、末梢特.なTリンパ球を活性化することができます。, ナタリズマブはVLA-4受容体を標的とするため、これらの特異的細胞は血液脳関門を効率的に通過することができず、したがって血液中に蓄積し、その検出を容易にする可能性がある。 PMLは後期段階のHIV感染の合併症でもあります。 JCV特異的エフェクターCD4およびCD8T細胞の検出がAIDS関連PMLに先行する可能性があるかどうかは、さらなる調査に値する興味深い点である。 しかし、AIDS関連PMLはナタリズマブ誘発PMLとは明らかに異なっている。, PMLを発症するほとんどのHIV感染患者は、cd4リンパ球減少症が深刻であり、CD8のt細胞機能もCD4の助けがないことによって変化する（25）。 さらに、ナタリズマブの患者とは異なり、血液脳関門を介したT細胞輸送の遮断はなく、これは血液中のJCV特異的TEM蓄積を防ぐことができる。

一緒に、我々の結果は、JCV特異的TEM応答を検出することができる機能的アッセイは、血液脳関門を介してリンパ球の人身売買を阻害する抗体で治療中にPMLを発症するリスクのある患者を識別するのに役立つかもしれないことを示唆している。,