概要

鞭毛原虫であるTrichomonas vaginalisは、世界中で最も一般的な非ウイルス性性感染症であるtrichomonosisの原因物質である。 Metronidazole抵抗力がある分離株の高められた流行を考慮に入れて、代わりとなる薬剤は巧妙な処置のために必要です。 天然物はほとんどの新薬の源であり、薬用植物の使用に関する人気のある知恵は、この検索の強力なツールです。, 本研究では、Mbyá-Guarani先住民族グループによって日常生活で広く使用されている10の薬用植物の活性は、七つの異なるT.vaginalis分離株に対して評価されました。 試験した水性抽出物のうち、Ｖｅｒｂｅｎａ ｓｐ． （Mbyá-グアラニー語でGuachu ka’a）とCampomanesia xanthocarpa（Mbyá-グアラニー語でGuavira）は、4.0mg/mLのMIC値が寄生虫に対する有効性の100％に達するT.vaginalisに対して最も高い活性を示した。 速度論的成長アッセイは、抽出物がインキュベーションの4時間後に完全な成長廃止を促進することを示した。, さらに，試験した抽出物はヒト赤血球に対して有意な溶血活性を促進しなかった。 我々の結果は、バーベナspの潜在的な活性を初めて示しています。 そして、T.vaginalisに対するC.xanthocarpa。 さらに、本研究は、先住民族の知識が新しいプロトタイプ抗原虫薬の重要な源であることを示しています。

1. はじめに

Trichomonas vaginalisは、世界中で最も流行している非ウイルス性性行為感染症であるtrichomonosisを引き起こすu生殖器ヒト管に寄生し、年間248万件の新しいケースを担当しています。, コロニー形成後、寄生虫は膣炎、尿道炎、および前立腺炎を引き起こす。 さらに、病原体は、有害な妊娠転帰および早産、不妊症、子宮頸がんの素因、および骨盤内炎症性疾患としての重大な結果と関連している。 重要なことに、トリコモナス症は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の伝達および獲得における補因子として作用する。 この伝染の影響にもかかわらず、治療上の工廠は制限して、metronidazoleおよびtinidazoleの両方の5nitroimidazoleの薬剤だけ、trichomonosisの処置のためのFDAによって承認されます。, 治癒率は高いが，治療障害が観察され，ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ分離株の抵抗性が治療障害の主な理由である。 この意味で，トリコモナス症の治療のための新しい選択肢の調査と二つの戦略に従うことができることは間違いなく必要である：（ｉ）新しい抗寄生虫薬の合理的な開発に不可欠である新しい治療標的の探索と（ｉｉ）新しい抗Ｔの調査, 膣は、5-ニトロイミダゾールとは構造的に異なる化合物であり、その結果、我々のグループによって示されるように異なるメカニズムによって作用する。

この文脈では、天然物、特に薬用植物は、生物活性分子の強力な供給源として計り知れない。 古くから、人々は一般的な感染症を治療するために植物を使用しており、これらの伝統的な薬のいくつかは依然として多様な病状の治癒の一部とし さらに、民族薬理学的情報に基づく検索は、植物の利用に関する膨大な経験的知識を救助する。, この文脈では、自然環境と膨大な遺伝資源に関して、ブラジルは民族薬理学に大きな関心のある国です。

先住民族は豊富な生物多様性情報を持ち、天然資源を捕獲して使用する方法を知っています。 伝統的な治療法や民俗知識によっていくつかの薬が発見されているにもかかわらず、ブラジルには122の先住民族がありますが、民族植物学的側面に関しては30％しか調査されていませんでした。, したがって、土着の医学によって使用される植物の研究は、土着の古代の知識を保存する伝統医学と生物環境を相互接続するために重要です。

寄生原虫は依然としてヒトおよび動物の健康に対する大きな脅威であり、多くの原虫疾患の治療に有効な薬物はほとんどありません。 抗原虫活性を有する植物の体系的なスクリーニングへの貢献者としての土着民族薬理学を考慮して、本研究では、抗Tを評価しました。, ブラジルの南に位置Mbyá-グアラニ先住民族の医学で使用される最も重要な薬用植物の膣活動。

2. 材料および方法

2.1. 寄生虫培養条件

本研究では、Tの七分離株。, 膣を使用した：アメリカ型文化コレクション（ATCC）から30236および30238;TV-LACM1、TV-LACM2、およびTV-LACM3（女性患者からの新鮮な臨床分離株）;TV-LACH1およびTV-LACH2（男性患者からの新鮮な臨床分離株）は、すべてLaboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas、Faculdade de Farmácia、UFRGS、ブラジル（UFRGS倫理研究委員会による倫理的承認を得たプロジェクト、番号18923）から使用された。 トリコモナスは、トリプチカーゼ-酵母抽出物-マルトース（TYM）培地（pH6.0）でaxenically培養し、10％の熱不活性化ウシ血清を補充し、37℃でインキュベートした。

2.2., 植物材料

植物材料は、ロンバ-ド-ピニェイロ、ポルト-アレグレ、RS、ブラジル（30°06’47.62″Sと51°07’37.85″W）に位置する先住民族Mbyá-Guaraniから2011年に収集されました。 この村はTekoá Anhetenguá（英語ではTrue Village）と名付けられており、200人が40家族に集まって地域に住んでいます。 村の女性は、人口全体が使用する薬用植物の知識を持ち、標本の収集を行った。 感染症のために土着の医学で日常的に使用されている十植物を収集した：アロエarborescensミルの葉。, (ICN173371)、Bidens pilosa L.の空中部分(ICN167397)、Rhipsalis bacciferaの空中部分(ICN167402)、Luehea divaricataの樹皮(ICN167403)、Trichilia spの根。 (ICN173126)、Campomanesia xanthocarpa O.Bergの葉。 (ICN167401)、Coix lacryma-jobi Linの葉。 (ICN167396)、シトラスリモニウムの葉(ICN167399)、シトラスreticulataの葉(ICN173127)、およびVerbena spの葉。 (167394) バウチャー標本は、リオ-グランデ-ド-スル大学（ICN）の植物園に寄託された。

2.3., 植物抽出物の調製

新鮮な植物抽出物は、60℃で60分間煎じることによって先住民族による伝統的な使用に準拠して調製した。 水性抽出物を凍結乾燥し、作業溶液を超純水中で8.0mg/mLで調製し、濾過（0.22μm）によって滅菌し、-20℃で保存した。

2.4。 抗トリコモナス膣アッセイ

テン水性抽出物は、T.vaginalisに対する活性のためにin vitroでスクリーニングした。 アッセイは、96ウェル中の4.0mg/mLの最終濃度でマイクロタイタープレートで行われた。, 抑制最小濃度（MIC）は八倍希釈（4.0–0.031mg/mL）を用いて決定され、栄養体の生存率は蛍光法に従って決定された。 トロフォゾイトのみを用いた陰性対照と8.0μmメトロニダゾールを用いた陽性対照（Sigma Chemical Co.、セントルイス、モーリシャス、アメリカ）。 実験は少なくとも三つの独立した実験で三つの実験で行った。 結果は、未処理の寄生虫と比較した生存栄養生物の割合として表された。

2.5., 水性抽出物の成長効果

T.vaginalisの成長に対する活性水性抽出物の効果を調べるために、速度論的成長曲線は、ATCC30236分離を用いて行われた。 2.0×105栄養体/mLの寄生虫初期密度は、TYM培地中のMIC値で抽出物とインキュベートした。 栄養生物体を72時間の間に血球計を用いて計数した。結果は栄養生物体数（105/mL）として表した。, 顕微鏡分析のために、コントロールおよび処理された寄生虫を10分間遠心分離して2,000rpmで4時間インキュベーション後に生物を濃縮し、調製物を光学顕微鏡（拡大×1,000）でトリパンブルー色素除外によって観察した。

2.6. 溶血アッセイ

このアッセイは、Rochaらによって使用された方法に従って行った。 . 健康な人間のボランティアからの血液型o陽性はAlseverの解決（1:1）と集められ、2,000rpmで5分間遠心分離されました。 赤血球画分をPBS1x(pH7.,0)再懸濁して1%赤血球懸濁液(v/v)を得た。 水性抽出物濃度は、感受性アッセイで決定された最小阻害濃度（ＭＩＣ）に従って選択された。 赤血球を37℃で1時間ag拌下で抽出物とインキュベートし、次いで3,000rpmで5分間遠心分離した。 上清の吸光度を540nmで測定した。 実験は三重に行われ、テストされた各サンプルによって引き起こされる溶血のパーセントはQuillaja saponariaからのサポニンの100%の溶血活性と比較して計算されました。

3., 結果と議論

この研究では、医学システムMbyá-グアラニーで使用される10薬用植物の水性抽出物の抗T.膣活性を評価しました。 重要なことに，試験した植物の中で，ｉｎｖｉｔｒｏで強力な抗Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ活性を有する二つの水性抽出物を見出した。 有望な抽出物はＶｅｒｂｅｎａｓｐ．のものである。 そしてカンポマネシア-キサントカルパ Verbena spからの抽出物。、4.0mg/mLで、すべての異なるトリコモナス分離株に完全な細胞毒性（寄生虫死の100％）を誘導する最適な抗T.膣活性を示した（図1（a））。, 同じ濃度でCampomanesia xanthocarpaの葉抽出物はまた、96％まで寄生虫の生存率を低下させる、非常に高い抗T.膣活性を示した（図1（b））。

他の水性抽出物は様々な結果を示した。 Bidens pilosaから得られた水性抽出物は、30236分離のみの栄養生存率を完全に廃止した（図1（c））。 Luehea divaricataの樹皮の抽出物は、テストされた各トリコモナス分離株で異なるT.vaginalis生存率の減少を誘導した（図1（d））。, Coix lacryma-jobiの葉は、平均して、T.vaginalis分離株の生存率の低下の75％を誘導したが、TV-LACH2分離株の場合、減少はわずか40％であった（図1（e））。 男性患者（TV-LACH1およびTV-LACH2）からの新鮮な臨床分離株は、女性患者（ATCCおよび新鮮な臨床）からの分離株よりも高い感受性を示したときにTrichilia spの根抽出。 を試験した（図1(f)）。 柑橘類のリモニウムからの葉の抽出物は、分離株の生存率を約40％低下させた（図1（g））。, アロエarborescensと柑橘類reticulataからの抽出物は、少なくとも一つの分離の50％の生存率を減少させた（図1（h）と1（i））、Rhipsalis bacciferaはわずか30％30236とTV-LACM2分離株の生存率を減少させた（図1（j））。

他の抽出物と比較して、Verbena sp. そしてC.xanthocarpaはt.vaginalisに対して最も有望な活性を示し、30236分離の最小阻害濃度を決定した（表1）。,

Aqueous extract
Verbena sp. Campomanesia xanthocarpa
MIC (mg/mL) 4.0 4.0
Hemolysis (%) ± S.D. 6.5 ± 0.02 7.6 ± 0.,01
表1
感受性アッセイによって決定された最良の抗トリコモナス膣活性およびそれぞれのMICを示した水性抽出物の溶血活性。

寄生虫の成長および生存率に対する最も活性な抽出物の影響を調べるために、速度論的成長曲線を行った。 コントロールは、インキュベーションの24時間後に古典的な成長ピークを示した;しかし、生物はバーベナspの抽出物で処理した。 およびC., キサントカルパは、インキュベーションの4時間後に、完全な成長廃止を誘発し（図2）、細胞死を示すトリパンブルー色素除去によって特徴的な青色を示した（図3）。

図2

バーベナspの水性抽出物で処理した後、Trichomonas vaginalis30236の速度論的成長曲線を単離する。 そして4.0mg/mLのCampomanesia xanthocarpa。 栄養生物成長は完全にインキュベーションの4時間で抽出物によって阻害された。, Data represent means ± standard deviation of at least three experiments, all in triplicate.


(a) Control

(b) Verbena sp.

(c) Campomanesia xanthocarpa


(a) Control
(b) Verbena sp.,
(c)Campomanesia xanthocarpa
図3

トリパンブルー色素除外による光学顕微鏡（拡大×1,000）における寄生虫の形態の顕微鏡解析。 (a)コントロール;(b)Verbena spの水性抽出物で4時間処理した後。;(c)Campomanesia xanthocarpaの水性抽出物による4時間の処理後。

C.xanthocarpaとVerbena spの可能性のある効果を調査するために。, 寄生虫膜上の抽出物およびまた、哺乳動物細胞に対する細胞毒性に関する予備データを有するために、これらの抽出物の溶血活性を行った。 バーベナsp. およびC.xanthocarpa抽出物をMIC値で試験し、それぞれ6.5および7.6％の赤血球溶解を示した（表1）。 これらの結果は，両抽出物がＭＩＣ値で有意な溶血活性を促進しなかったことを示し，寄生虫生存率低下に関与する作用機序はおそらく寄生虫膜破壊を伴わないことを示した。, さらに重要なことに、これらの知見は、両方の抽出物がヒト赤血球を溶解しなかったので、哺乳動物細胞に対して毒性ではないことを示唆している。

この研究は、薬用植物に関する先住民族の知識を救出するのに貢献しています。 原住民のムビャ-グアラニー族はバーベナspを使用している。 （Mbyá-Guaraniの言語のGuachu ka’a）、熱のような感染症の徴候の救助のための茶として、。 これはVerbena spに関連する文献と一致しています。 炎症性障害、皮膚の火傷、無月経、うつ病、および胃疾患に対する鎮静剤、鎮痛剤としての注入。, さらに，本種はフラボノイド，イリドイド配糖体，フェニルプロパノイド配糖体，ステロール，トリテルペン，複合糖質など様々な化学成分を有しており，生物学的活性はそれらに部分的に起因する可能性がある。 さらに、この部族は、下痢、胃の痛み、および虫の治療のためにC.xanthocarpa（Mbyá-Guarani言語でGuavira）の葉を利用しています。, この植物はdepurative、antidialrhoeic、洗剤およびantirheumaticとしてブラジルの南で伝統的に、血のコレステロールを減らすために使用され、これらの特性はタンニン、サポニンおよびフラボノイド（ケルセチン、myricetin、ケルシトリンおよびルチン）、C.xanthocarpaの葉で現在の混合物に帰因するかもしれません。

植物の歴史的使用の救助民族薬理学は、薬用植物の選択と研究の理論的根拠を与えるため、生物検査にとって価値があると認識されている。, Ｖｅｒｂｅｎａｓｐ．の抗原虫活性に関する最初の報告について述べた。 およびC.xanthocarpa。 さらに，ＶｅｒｂｅｎａｃｅａｅおよびＭｉｒｔａｃｅａｅ科の他の種をＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓに対して試験したが，成功しなかった。 いくつかの生物多様性と異なる集団の伝統的な知識は、新しいプロトタイプ抗T.vaginalisを検索するための研究を導いてきました。 最近，伝統的にＣａａｔｉｎｇａからＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓに対して使用されている植物の可能性が報告された。 Calzada et al., メキシコの伝統医学のu生殖路の無秩序に使用される植物がこの原虫に対して効果を示したことを示しました。 南アフリカの性病に対して使用されるAmaryllidaceae種はまた、T.vaginalisに対して有望な活性を示した。

公衆衛生におけるトリコモナス症の影響および抵抗性t.vaginalis分離株の緊急数を考慮すると、この感染の治療のための選択肢が必要である。 天然物は活性分子の有望な供給源であり、民族薬理学のアプローチは薬用植物の人口の知識を救う。, 化学および病理学の調査と結合されるこの知恵は革新し、安全で、入手しやすい薬剤のbioprospectionの貴重な価値を示す。 このパイオニア研究は、バーベナspの抗T.vaginalis活性に関する関連する結果を示した。 そして、c.xanthocarpa、伝統的に先住民族Mbyá-グアラニーによって感染症のために使用される植物。 強い抗t.vaginalis活性を示しているにもかかわらず、このレポートは、この知恵の流産を避け、先住民の知識を救出しました。,

著者の貢献

Clara Lia Costa BrandelliとPatrícia de Brum Vieiraはこの作品にも同様に貢献しました。

謝辞

この作品は、CAPESとFALEGSのNANOBIOTEC-Brazilプログラムによってサポートされました。 著者らは、この研究の達成を可能にし、貴重な情報を得てくれたJosé Cirilo Pires Morinico族長（mbyá-Guarani族）に感謝します。 アレクサンドル-ホセ-マセドとティアナ-タスカは、cnpqの研究員フェローシップに感謝します。