A Beginner’S Guide to Next Generation Sequencing(NGS)Technology

2003年のヒトゲノムプロジェクトの完了は、次世代シーケンシング(NGS)と呼ばれる迅速で手頃な価格で正確なゲノム解 正確で、費用効果が大きい配列の結果をもたらすために”第一世代の配列”の技術にNGSの造り。

フレッド-サンガーは、最初の全DNAゲノム、ウイルスファージの配列決定？X174、1977年。, 同年、サンガーはゲノム時代の将来のバックボーンであるDNAシークエンシング技術を開発しました。 彼の技術は、チェーン終了法を使用しました。 これは現在、ゲノム配列決定の”第一世代の技術”と見なされています。

Sangerシーケンシング（または鎖終端法）はシーケンシング技術の第一世代であるため、それを理解することは非常に重要です。 ヒトゲノムプロジェク,

サンガーシーケンス法

サンガーシーケンス法は、3’ヒドロキシル基を欠き、代わりに水素原子を有するデオキシヌクレオシド三リン酸塩（dntp）の一種であるジデオキシヌクレオチド（ddNTPs）に依存している。 これらの塩基が成長するDNA配列に結合すると、他の塩基に結合することができないため、複製を終了する。 サンガーシーケンシングを実行するには、配列決定される遺伝情報を含む溶液にプライマーを追加し、溶液を四つのPCR反応に分割します。, 各反応は、ddNTP（A、T、G、およびC ddNTP基）で置換された四つのヌクレオチドのいずれかを有するdNTPミックスを有するaを含む。 レプリケーションがランダムに終了するので、PCRの最後に、あなたの四つの反応のそれぞれが様々な長さのPCR産物を生成します。 4つの車線のゲルのサンプルを動かすことによって、各順序が同じ元の材料から複製されたので順序を一緒につなぐことができる。 DdNTPsが太字でdntpが太字でない例は次のとおりです。

シーケンスはATGCTCAGです。,

あなたの四つの反応はあなたを与える：
ddATPとの反応：A、ATGCTCA、ATGCTCAG
ddctpとの反応：ATGC、ATGCTC、ATGCTCAG
ddTTPとの反応：AT、ATGCT、ATGCTCAG

一度ゲルを実行するすべての反応は、このようなものになります（Olwen Reinaによる画像）：

各バンドは異なる長さのコードを示します。 例えば、バンドは”A”の下に右であるシーケンスを象徴している：”ATGCTCA”

まだ混乱していますか？

パーティーゲームを想像してみましょう。 ゲームは推測ゲームです。, ここでは、それが再生される方法です：

あなたは数字を考えていると、グループはそれを推測する必要があります。 トリッキーな部分は、数字の長さが200桁であるということです。 あなたは音を出さずに頭の中の数字の数字を読んでいます。 すべてのそう頻繁に人はあなたを中断し、あなたは彼らにあなたがちょうど考えていた一桁とそれが200の順序でどこにあるかを伝えます。 あなたが中断されるたびに、再び開始する必要があります。 あなたは数時間後に出発し、グループは200桁の番号を把握する必要があります。, 彼らはあなたがそれらを与えた情報をまとめなければなりません、例えば25番目の数字は5、40番目の数字は0などでした。 彼らの中断からの情報を使用して、彼らはあなたに与えた番号を繰り返すことができます。

これは世界で最も嘆かわしいゲームのように聞こえますが、シーケンシングには非常にうまく機能します！

残念ながら、それは遅く、高価であり、（以前は）放射性物質に依存していました。 この押された研究者との新しい形式のゲノムの順序付けなどを利用できます。,

次世代シーケンシング技術

ゲノムシーケンシングの最大の進歩は、人員とコストの削減につながる、スピードと精度を高めてきました。 速度は平行分析および高い効率の技術のおかげである。 それは白鯨を読むために4歳を得ることと、ドラマ専攻の束にそれぞれ段落を与え、一度に読むように頼むことの違いです。

シーケンシングマシンは、サンガーが彼の方法を開発して以来、乱暴に改善されています。, 1987年、アプライド-バイオシステムズはAB370と呼ばれる自動シーケンシングマシンを初めて導入した。 機械はゲルを必要としないでSangerのチェーン終了方法を使用した毛管電気泳動と呼出される方法に頼った。蛍光標識された鎖末端ｄｄｎｔｐをＰＣＲ反応混mixに添加する。 サンガーシーケンス法により、様々な長さのPCR産物が作成され、そのサイズに応じて分離される。 サイズは、ＰＣＲ産物の全体的な負電荷によって測定される。 電荷が負であるほど、フラグメントは長くなります。, 上記のddNTPの組み込みの例を取り、太字の文字が蛍光色素が付いたddNTPsであると想像してください。 キャピラリーの正極に向かって引っ張られると、レーザービームが通過し、ベースタイプの特徴であるddNTPに取り付けられた蛍光色素からの光のフラッシュを引き起こします（例えば、aは緑、Tは黄色、Gは青、Cは赤）。 このようにして、ゲノムは慎重に読み取られる。

ここでの最大の違いは速度とコストでした。, AB370は、一度に96塩基、一日あたり500K塩基を検出することができ、並列解析と高スループットセットアップを使用して600塩基の読み取り長さを持ってい この形式の配列決定は、ヒトゲノムプロジェクトの完成のための主要なツールとなった。

NGSは第一世代のシーケンシングとどのように比較されますか？

NGSは、精度と速度を向上させるだけでなく、人手とコストを削減することを特徴としています。 ゲノムを配列することが安く、便利で、または簡単であった時代は決してありませんでした。, 間違いなく、最大の改善は、シーケンシング速度を増加させた並列解析の開発でした。

今私たちを遅くする唯一のことは、結果の解釈です！