päätökseen Human Genome Project vuonna 2003 ohjattiin uuden aikakauden nopea, edullinen ja tarkka genomin analyysi sanottujen Seuraavan Sukupolven Sekvensointi (NGS). NGS perustuu ”ensimmäisen sukupolven sekvensointi” teknologiaa tuottaa tarkkoja ja kustannustehokkaita sekvensoinnin tulokset.

Fred Sanger sekvensoi ensimmäisen koko DNA-genomin, viruksen Fagen?X174, vuonna 1977., Samana vuonna Sanger kehitti genomikauden tulevaisuuden selkärangan: DNA-sekvensointiteknologian. Hänen tekniikkansa käytti ketjun päättymismenetelmää. Tätä pidetään nyt genomin sekvensoinnin ”ensimmäisen sukupolven teknologiana”.

Koska Sanger sekvensointi (tai ketju irtisanominen menetelmä) on ensimmäisen sukupolven sekvensointi teknologia, sen ymmärtäminen on erittäin tärkeää. Human Genome-projekti alkoi Sanger sequencing-tekniikalla.,

, Että Sanger-Sekvensointi on Menetelmä

Sanger-sekvensointi on menetelmä perustuu dideoxynucleotides (ddNTPs),tyyppi deoxynucleoside trifosfaateiksi (dNTPs), että niistä puuttuu 3′ – hydroksyyli-ryhmä ja vety-atomin sijaan . Kun nämä emäkset sitoutuvat kasvavaan DNA-sekvenssiin, ne lopettavat replikaation, koska ne eivät pysty sitomaan muita emäksiä. Suorittaa Sanger Sekvensointi, voit lisätä alukkeiden ratkaisu, joka sisältää geneettistä tietoa voidaan sekvensoida, sitten jakaa ratkaisu neljään PCR-reaktioita., Jokainen reaktio sisältää kanssa dNTP mix, jossa on yksi neljän nukleotidin substituoitu ddNTP (A, T, G ja C ddNTP ryhmät). PCR: n lopussa jokainen neljästä reaktiostasi tuottaa PCR: n tuotteita eri pituisina, koska replikaatio lopetetaan satunnaisesti. Suorittamalla näytteet geelillä, jossa on 4 kaistaa, voit koota sekvenssin, koska jokainen sekvenssi on toistettu samasta alkuperäisestä materiaalista. Tässä on esimerkki, jossa ddNTPs ovat rohkeita ja dNTPs eivät ole:

– sekvenssi on ATGCTCAG.,

neljä reaktiot antaa:
Reaktio ddATP: A, ATGCTCA, ATGCTCAG
Reaktio ddGTP: ATG, ATGCTCAG
Reaktio ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
Reaktio ddTTP: AT, ATGCT, ATGCTCAG

Kaikki reaktiot kun ajaa geeli voisi näyttää tältä (Kuva Olwen Reina):

Jokainen bändi tarkoittaa eri pituisia koodi. Esimerkiksi ”A”: n alla oleva yhtye symboloi sekvenssiä:”ATGCTCA”

vielä hämmentynyt?

Let ’ s imagine a party game. Peli on Arvausleikki., Näin sitä soitetaan:

ajattelet numeroa ja ryhmän on arvattava se. Hankalinta on, että luku on pituudeltaan 200-numeroinen. Luet numeron numeroita päässäsi ääntelemättä. Joka niin usein henkilö keskeyttää, ja sano heille yhden numeron olit vain ajatella, ja missä se on järjestyksessä 200. Aina kun keskeytät, sinun täytyy aloittaa alusta. Lähdet muutaman tunnin kuluttua ja ryhmän on selvitettävä 200-numeroinen luku., Ne täytyy koota tiedot annoit heille, esimerkiksi 25 numero oli 5, 40 numero oli 0, ja niin edelleen. Käyttämällä tietoa niiden keskeytykset, he voivat toistaa numero he antoivat sinulle.

Vaikka tämä kuulostaa tylsin peli maailmassa, se toimii erittäin hyvin sekvensointi!

valitettavasti se on hidas, kallis ja (aiemmin) luottaa radioaktiivisiin materiaaleihin. Tämä sai tutkijat kehittämään uusia ja parempia genomisekvensoinnin muotoja.,

Seuraavan Sukupolven Sekvensointi Teknologiat

suurin kehitys genomikartoituksen on kasvanut nopeus ja tarkkuus, mikä vähentää työvoimaa ja kustannuksia. Nopeus on rinnakkaisen analyysin ja suuren läpimenotekniikan ansiosta. Ero on siinä, että saa 4-vuotiaan lukemaan Moby Dickin ja antaa kappaleen jokaiselle Draamamestareille ja pyytää heitä lukemaan heti.

Sekvensointikoneet ovat parantuneet hurjasti Sangerin kehitettyä menetelmänsä., Vuonna 1987 Applied Biosystemsistä tuli ensimmäinen, joka otti käyttöön automaattisen sekvensointikoneen, nimeltään AB370. Kone vedota menetelmää, jota kutsutaan kapillaari elektroforeesi, että käytetään Sanger on ketjun päättämisestä menetelmä ilman geeliä.

Fluoresoivasti merkitty ketjun päättämisestä ddNTPs lisätään PCR-reaktio yhdistelmä. Sangerin sekvensointimenetelmällä luodaan eripituisia PCR-tuotteita, jotka sitten erotetaan niiden koon mukaan. Koko mitataan PCR-tuotteen negatiivisella kokonaisvarauksella. Mitä negatiivisempi lataus, sitä pidempi katkelma., Ota yllä esimerkki ddNTP yhtiöittäminen ja kuvitella, että rohkea kirjaimet ovat ddNTPs kanssa fluorochrome liitteenä. Koska fragmentit ovat veti kohti positiivista elektrodia kapillaari (ks. kuva alla), ne kulkevat lasersäteen, joka laukaisee salaman valo fluorochrome kiinnitetty ddNTP, joka on ominainen pohja tyyppi (esimerkiksi, vihreä ja keltainen T, sininen G, punainen C). Näin genomi luetaan tarkkaan.

suurin ero tässä oli, nopeus ja kustannukset., AB370 pystyi havaitsemaan kerralla 96 emästä, 500k emäksiä päivässä, ja sen lukuaika oli 600 emästä rinnakkaisanalyysin ja suuren suoritustehon avulla. Tästä jaksottamisen muodosta tuli tärkein työkalu ihmisen genomiprojektin loppuun saattamiseen.

miten NGS vertaa ensimmäisen sukupolven sekvensointiin?

NGS on ominaista parannettu tarkkuus ja nopeus, mutta myös vähentää työvoimaa ja kustannuksia. Koskaan ei ole ollut aikaa, jolloin perimän sekvensointi on ollut yhtä halpaa, kätevää tai suoraviivaista., Luultavasti suurin parannus on ollut kehityksen rinnakkainen analyysi, joka lisäsi sekvensointi nopeus.

ainoa asia, joka hidastaa meitä nyt on tulosten tulkinta!

onko tämä auttanut sinua? Jaa sitten verkkosi kanssa.

Kirjoittanut Olwen Reina