Oppimisen Tavoitteet

  • Muista, dideoxynucleotide sekvensointi

Sanger sekvensointi, joka tunnetaan myös nimellä ketju-irtisanominen sekvensointi, tarkoittaa menetelmää, DNA: n sekvensointi kehittänyt Frederick Sanger vuonna 1977. Tämä menetelmä perustuu vahvistusta DNA-fragmentti voidaan sekvensoida DNA-polymeraasi ja sisällyttäminen muutettu nukleotidien, erityisesti dideoxynucleotides (ddNTPs).,

klassisen ketju-irtisanominen menetelmä vaatii yksijuosteisen DNA: n mallin, DNA-aluke, DNA-polymeraasi, normaali deoxynucleotidetriphosphates (dNTPs), ja muokatut nukleotidit (dideoxyNTPs), että lopettaa DNA-juosteen venymä. Nämä ketjun päättämisestä nukleotidien puuttuu 3′-OH-ryhmä tarvitaan muodostumista phosphodiester sidos kahden nukleotidin, jolloin DNA-polymeraasi lopettaa extension DNA kun ddNTP on otettu. Se ddNTPs voidaan radioaktiivisesti tai fluoresoivasti merkitty tunnistus automaattinen sekvensointi koneita.,DNA-näyte jaetaan neljään erilliseen sekvensointireaktioon, jotka sisältävät kaikki neljä standardideoksinukleotidia (dATP, dgtp, dCTP ja dTTP) sekä DNA-polymeraasin. Jokaisen reaktio on lisätty vain yksi neljästä dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, tai ddTTP). Seuraavat kierrosta template DNA-laajennus sidottu pohjamaali, tuloksena DNA-fragmentit ovat lämpö denaturoitu ja erotettu kokoa käyttämällä geeli elektroforeesi. Tämä on usein suoritetaan käyttämällä denaturoivaa polyakryyliamidia-urea-geeli, jossa kunkin neljän reaktioita suorittaa yksi neljä erillistä kaistaa (kaistat A, T, G, C)., DNA-nauhat voidaan sitten visualisoida autoradiografialla tai UV-valolla ja DNA-sekvenssi voidaan lukea suoraan röntgenfilmistä tai geelikuvasta.

Kuva: Sanger-sekvensointi: Erilaisia Sanger sekvensointi, jotka kaikki riippuvat sekvenssi on pysäyttää päättämisestä dideoxynucleotide (mustat palkit).,

Tekniset muunnelmia ketju-irtisanominen sekvensointi kuuluu koodaus, jossa nukleotidit sisältävät radioaktiivista fosforia radioleimaamiseen, tai käyttämällä pohjamaali leimattu 5′ pää, jossa on fluoresoiva väriaine. Dye-primer-sekvensointi helpottaa lukemista optisessa järjestelmässä nopeampaan ja taloudellisempaan analyysiin ja automaatioon. Myöhemmin kehitys Leroy Hood ja työtovereiden fluoresoivasti merkitty ddNTPs ja pohjamaalit asettaa vaiheessa automatisoitu, suurikapasiteettisten DNA: n sekvensointi. Ketjusovitusmenetelmät ovat yksinkertaistaneet DNA-sekvensointia huomattavasti., Viime aikoina on kehitetty väriaine-terminator-sekvensointia. Väriaine-terminator sekvensointi hyödyntää merkintöjä ketjun terminator ddNTPs, joka mahdollistaa sekvensointi yksi reaktio, pikemminkin kuin neljä reaktioita, kuten merkintä-pohjamaali menetelmä. Väriaineiden terminaattorien sekvensoinnissa jokainen neljästä dideoksinukleotidiketjun terminaattorista merkitään fluoresoivilla väriaineilla, joista jokainen säteilee valoa eri aallonpituuksilla.,

Kuva: Kromatografin: Tämä on esimerkki lähtö Sanger sekvensointi lukea käyttämällä fluoresoivasti merkitty väriaine-terminaattoreita. Neljää DNA-emästä edustavat eri värit, joita ohjelmisto tulkitsee antamaan edellä olevan DNA-sekvenssin.

Automatisoitu DNA-sekvensointi välineitä (DNA sekvensserit) sekvenssi voi jopa 384 DNA-näytteitä yhden erän (run) enintään 24 kulkee päivässä., DNA-sekvensserit suorittaa capillary electrophoresis koko erottamiseen, tunnistamiseen ja tallennus väriaineen fluoresenssi, ja tietoja tuotos kuin loisteputki huippu jäljittää kromatogrammeista. Automaatio on johtanut kokonaisten genomien jaksottamiseen.

– Näppäintä Pistettä

  • puute toisen deoxy-ryhmä on dNTP joten se ddNTP, pysähtyy sisällyttäminen edelleen nukleotidit, tämä irtisanominen luo DNA pituudet pysähtyi jokaisen nukleotidin, tämä on keski edelleen tunnistaa kunkin nukleotidin.,
  • Erilaisia tarroja voidaan käyttää, ddNTPS, dNTPs ja alukkeet voivat kaikki olla merkitty radioaktiivisuuden ja fluoresoivasti.
  • Käyttää loisteputki tarroja, dideoxy sekvensointi voidaan automatisoida jolloin high-throughput-menetelmät, joita on käytetty sekvenssi koko genomit.

avainsanat

  • kromatogrammi: kromatografin visuaalinen ulostulo. Yleensä graafinen näyttö tai histogrammi.
  • dideoxynucleotide: Kaikki nukleotidin muodostettu deoxynucleotide menetys on toisen hydroksi ryhmä deoxyribose ryhmä