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El Natalizumab, un anticuerpo utilizado para tratar la esclerosis múltiple recidivante (em), previene el tráfico de linfocitos activados, incluidos los linfocitos autorreactivos, a través de la barrera hematoencefálica (BBB). El principal efecto adverso del natalizumab es la leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), una enfermedad desmielinizante devastadora causada por la replicación del poliomavirus JC humano (VJC) en oligodendrocitos y astrocitos (1, 2)., La inhibición del Natalizumab del tráfico de células T efectoras de la sangre al sistema nervioso central (SNC) podría favorecer la replicación local del VJC (3-7).

aquí, examinamos la presencia de células T de memoria efectora específicas de JCV (TEM) en la sangre de pacientes con EM después de la activación del antígeno durante la noche ex vivo. In vivo, los números específicos de TEM disminuyen una vez que se elimina el antígeno cognado (8-10), y su presencia puede apuntar a la replicación continua del VJC. Las TEM liberan rápidamente citoquinas como el interferón gamma (IFN-γ) cuando se reexponen al antígeno., Un ensayo previo de inmunoabsorción enzimática (ELISPOT) examinó la expresión de IFN-γ en células T después de la activación a largo plazo con péptidos JCV durante un máximo de 14 días (11). Sin embargo, la activación prolongada permite que la memoria de células T inactivas a largo plazo se reactive y se expanda, lo que significa que una respuesta positiva no significa necesariamente una respuesta inmunitaria en curso. Aquí, primero examinamos la presencia de TEM específica para el VJC en dos pacientes con EM que desarrollaron LMP. El primer paciente fue diagnosticado con LMP después de 39 meses con natalizumab (39 infusiones) (Departamento de Neurología, Hospital Pitié-Salpétrière)., Tenía 39 años y 10 años de historia de esclerosis múltiple remitente-recidivante.antes del natalizumab, había recibido ciclofosfamida y mitoxantrona. La LMP se confirmó mediante RMN y PCR de VJC en líquido cefalorraquídeo (LCR). Cuando se probó la TEM específica del VJC, 8 semanas después del inicio de los síntomas de la LMP, tenía 1.040 copias del genoma del VJC por ml de LCR (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Sus células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se activaron in vitro en medio aim-V y Albumax (Invitrogen) durante 16 h con JCV purificado (cepa MAD-4; LGC Promochem; 104,5 dosis infecciosa de cultivo tisular al 50% /0,2 ml)., No se añadió interleucina 2 recombinante (IL-2). Se añadió a cada pocillo una cantidad de virus correspondiente a 5.534 UFP. Esto correspondió a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,02. Las células fueron probadas para IFN-γ intracelular por citometría de flujo. La mortalidad celular tras la activación nocturna fue inferior al 5%. Como se muestra en la Fig. Se detectaron células respondedoras 1A y andB, B en los subconjuntos de células T CD4 y CD8, y la mayoría de ellas tenían el fenotipo ccr7− CD45RA característico de los efectores de memoria (12)., Los anti-JCV TEM también fueron detectados por IFN-γ ELISPOT (anticuerpos de captura y detección, clones 1-D1 y K7-B6-1, respectivamente; mabtech) después de 16 h de activación con péptidos purificados JCV o VP-1 (una mezcla de 14 piscinas de péptidos de 15 aminoácidos superpuestos que cubren toda la proteína JCV VP-1) (Fig. 1C). La segunda paciente tenía 46 años y 11 años de historia de esclerosis múltiple remitente-recidivante.antes del natalizumab, había recibido interferón beta, acetato de glatirámero, azatioprina y mitoxantrona. Fue remitida al centro de EM del Hospital Tenon para su reevaluación después de 24 infusiones de natalizumab., Una resonancia magnética cerebral realizada en mayo de 2012 detectó una lesión sospechosa pequeña, lineal, T2-hiperintensa en la región frontal derecha yuxtacortical. La primera muestra de LCR fue negativa para VCJ. La repetición de la RM después de la retirada del natalizumab reveló un aumento en el tamaño de la lesión, lo que llevó a dos exámenes adicionales del LCR, ambos negativos para el VJC. La PCR plasmática del VCJ se realizó 2 y 4 meses después del inicio de la LMP. Ambas muestras de plasma fueron negativas. La biopsia cerebral realizada en septiembre de 2012 confirmó finalmente el diagnóstico de LMP.,

detección de células T de memoria efectora específicas de JCV (TEM) en sangre de dos pacientes con LMP tratados con natalizumab. En los paneles a y B, el PBMC de un paciente que desarrolló LMP después del tratamiento con natalizumab (39 perfusiones) se activó con el virus JC purificado durante la noche y luego se probó para IFN-γ intracelular mediante citometría de flujo en los subconjuntos de células T CD4 y CD8 (A y B, respectivamente). La expresión de CCR7 y CD45RA en células IFN-γ positivas y negativas también se muestra para las células T CD4 (A) y las células T CD8 (B)., En el panel C, PBMC de 2 pacientes que desarrollaron LMP con natalizumab (el paciente 1 y el paciente 2 recibieron 39 y 24 perfusiones, respectivamente) se activaron durante la noche con el virus JC purificado y/o con un conjunto de péptidos VP1 antes de IFN-γ ELISPOT. El número de puntos de IFN-γ por 0,25 × 106 PBMC tras la activación nocturna con pools de péptidos de JCV y JCV purificados fue de 54 y 21, respectivamente (bien no tratado, 0 puntos) en el paciente 1. En el paciente 2, el VJC purificado produjo 15 puntos (bien no tratado, 0 Puntos).,

el análisis ELISPOT de la respuesta IFN-γ Al VJC, realizado 2 días después de la última infusión de natalizumab, mostró la presencia de TEM específico del VJC en sangre (Fig. 1C). Curiosamente, los números de TEM circulantes específicos del VJC fueron más bajos que en el primer paciente con LMP, que puede haber tenido un nivel más alto de replicación del VJC en el cerebro, ya que la PCR del VJC en el LCR fue positiva en el primer paciente y negativa en el segundo.,

también se examinó la presencia de TEM específica del VJC por ELISPOT en una serie de 62 pacientes con EM con EM remitente-recidivante tratados con natalizumab de acuerdo con los Términos de comercialización europeos, así como en 35 pacientes con EM que no estaban recibiendo ningún tratamiento modificador de la enfermedad, y un grupo de 40 donantes sanos emparejados por edad y sexo con pacientes con EM. Las características de los pacientes con EM se muestran en la tabla 1. Los pacientes y los donantes sanos dieron su consentimiento escrito para participar en el estudio, que fue aprobado por el Comité de ética del Hospital Pitié-Salpêtrière, París., Una respuesta ELISPOT se consideró positiva si el número corregido de manchas (número de manchas en pozos activados menos número de manchas en pozos no tratados) era de al menos 10, con menos de 10 manchas en pozos no tratados.

la proporción de muestras positivas fue del 2,5% en donantes sanos (Fig. 2A). En el grupo con EM, el porcentaje de pacientes positivos aumentó con el tiempo de tratamiento con natalizumab (Fig. 2B y andC), C), del 8,8% en pacientes con EM no tratados al 15,9% en pacientes tratados con natalizumab durante menos de 24 meses y al 27% en pacientes tratados durante más de 24 meses (Fig., 2C) (significativo para pacientes tratados durante más de 24 meses frente a EM no tratada y frente a sujetos control). Este aumento en la frecuencia de detección de las respuestas TEM del VJC sugirió que el tratamiento prolongado con natalizumab favorecía la reactivación del VJC.

aumento de la detección de TEM específico del VJC en pacientes tratados con natalizumab. Los paneles A y B representan el número de puntos IFN-γ por 0,25 × 106 PBMC después de la activación nocturna con virus JC purificado en 40 donantes sanos (a) y en 99 pacientes con EM de acuerdo con el tiempo de natalizumab (B)., En el panel B, los 2 pacientes con LMP están indicados por un triángulo cerrado y un cuadrado cerrado. La línea discontinua representa el corte de positividad (ver el texto). El Panel C representa el porcentaje de muestras positivas a JCV-ELISPOT en donantes sanos (EH), pacientes control (EM no tratada) y pacientes tratados con natalizumab durante un máximo de 2 años (0-24 meses) o más (24-48 meses). Algunos pacientes tratados con natalizumab se evaluaron en 2 o 3 momentos. El número de muestras de sangre analizadas se indica a continuación. El análisis estadístico utilizó la prueba de Fisher., El Panel D muestra los resultados de JCV ELISPOT para pacientes que fueron evaluados en 2 o 3 puntos de tiempo. El Panel E muestra los resultados de la PCR urinaria del VJC y del ELISPOT del VJC en 50 pacientes con EM tratados con natalizumab y en 14 donantes sanos evaluados con ambos ensayos. El Panel F muestra los resultados de la serología JCV y ELISPOT JCV en 56 pacientes con EM en natalizumab probado con ambos ensayos.

se tomaron muestras de un subgrupo de pacientes tratados con natalizumab al menos dos veces (Ver Tabla 1). Como se muestra en la Fig. 2D, la mayoría de estos pacientes se volvieron o permanecieron Positivos durante el período de muestreo.,

el riñón es un reservorio importante para el VJC. Un porcentaje significativo de la población general excreta el virus en su orina, pero no tiene evidencia de VJC en su sangre (13-15). Además, la presencia de ADN del VJC en el cerebro parece ser independiente de su presencia en el riñón (16). Como se muestra en la Fig. 2E, 60% de los pacientes con EM con TEM detectable de VJC en sangre no tenían VJC detectable en orina, y 69% de los pacientes con PCR positiva de VJC en orina no tenían TEM detectable de VJC. También se observó excreción urinaria del VJC sin TEM detectable del VJC en donantes sanos (Fig. 2E)., Esto sugiere que la presencia de replicación del VJC en el riñón no necesariamente conduce a una TEM detectable del VJC en la sangre. Por el contrario, esto plantea la posibilidad de que la detección de TEM del VJC en sangre pueda reflejar la replicación extrarrenal en curso del VJC.

en un estudio en el que se utilizó un nuevo método de ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas JCV (ELISA) (17), la seroprevalencia estimada del JCV en pacientes con EM tratados con natalizumab fue del 53,6% (17). La seropositividad no necesariamente se correlaciona con la presencia de respuestas TEM, que está relacionada con la reactivación del virus., Las células plasmáticas de larga vida pueden persistir en la médula ósea durante largos períodos de tiempo, tal vez durante décadas, manteniendo títulos de anticuerpos séricos sostenidos sin replicación activa del patógeno (18, 19). Utilizamos el mismo método ELISA para probar 56 de nuestros pacientes con EM tratados con natalizumab que habían sido probados por JCV ELISPOT, incluidos los 2 pacientes con LMP. Como se muestra en la Fig. 2F, el 53,6% de los pacientes fueron seropositivos y el 16,1% ELISPOT positivo. El veintisiete por ciento de los pacientes seropositivos al VJC tenían TEM detectable en la sangre. Solo un paciente con VJ ELISPOT positivo fue seronegativo., Según Gorelik et al., la tasa de falsos negativos del ensayo serológico JCV es del 2,5% (17).

nuestros resultados muestran que la frecuencia de detección de las respuestas TEM del VJC en pacientes con EM aumenta con el tiempo de natalizumab. Un estudio previo también mostró un aumento en las respuestas de los linfocitos T AL VJC después de 12 meses de terapia con natalizumab, pero este estudio se limitó a 18 meses de tratamiento (20), mientras que encontramos que el aumento más fuerte en las respuestas de los linfocitos T efectores se produjo después de 24 meses.,

por lo tanto, nuestros resultados apuntan a la reactivación del VJC durante el tratamiento con natalizumab, incluso en sitios extrarrenales. Se ha detectado VJC en el cerebro de individuos VIH-seronegativos sin LMP (21). La disminución de la inmunovigilancia del SNC inducida por el natalizumab podría favorecer la reactivación local del virus que puede comenzar como replicación intermitente asintomática del virus, pero podría evolucionar hacia una replicación sostenida del virus y luego a LMP. La reactivación del Virus podría activar linfocitos T específicos periféricos, a través de células presentadoras de antígenos, en lugares como los ganglios linfáticos cervicales que drenan el cerebro (22-24)., Como el natalizumab se dirige al receptor VLA-4, Estas células específicas no pueden cruzar eficazmente la barrera hematoencefálica y, por lo tanto, podrían acumularse en la sangre, facilitando su detección. La LMP también es una complicación de la infección por VIH en etapa tardía. Si la detección de linfocitos T CD4 y CD8 efectores específicos del VJC puede preceder a la LMP asociada al SIDA es un punto de interés que merece mayor investigación. Sin embargo, la LMP asociada al SIDA es claramente diferente de la LMP inducida por natalizumab., La mayoría de los pacientes infectados por el VIH que desarrollan LMP tienen linfopenia CD4 profunda, que también altera la funcionalidad de las células T CD8 debido a la falta de ayuda CD4 (25). Además, a diferencia de los pacientes tratados con natalizumab, no hay bloqueo del tráfico de células T A través de la barrera hematoencefálica, y esto puede prevenir la acumulación de TEM específica del VJC en la sangre.

en conjunto, nuestros resultados sugieren que los ensayos funcionales capaces de detectar respuestas TEM específicas del VJC podrían ayudar a identificar a los pacientes en riesgo de desarrollar LMP durante el tratamiento con anticuerpos que inhiben el tráfico de linfocitos a través de la barrera hematoencefálica.,