resumen
Trichomonas vaginalis, un protozoo flagelado, es el agente causante de la tricomonosis, la enfermedad de transmisión sexual no viral más común en todo el mundo. Teniendo en cuenta el aumento de la prevalencia de aislados resistentes a metronidazol, los medicamentos alternativos son esenciales para el éxito del tratamiento. Los productos naturales son la fuente de la mayoría de los nuevos medicamentos, y la sabiduría popular sobre el uso de plantas medicinales es una herramienta poderosa en esta búsqueda., En este estudio, se evaluó la actividad de 10 plantas medicinales ampliamente utilizadas en la vida diaria por el grupo indígena Mbyá-Guaraní frente a siete aislados diferentes de T. vaginalis. Entre los extractos acuosos probados, Verbena sp. (Guachu ka’a en lengua Mbyá-Guaraní) y Campomanesia xanthocarpa (Guavira en lengua Mbyá-Guaraní) mostraron la mayor actividad frente a T. vaginalis con un valor de CMI de 4,0 mg/mL alcanzando el 100% de eficacia frente al parásito. Los ensayos de crecimiento cinético mostraron que los extractos promovieron la abolición completa del crecimiento después de 4 h de incubación., Además, los extractos probados no promovieron una actividad hemolítica significativa contra los eritrocitos humanos. Nuestros resultados muestran por primera vez la actividad potencial de Verbena sp. y C. xanthocarpa contra T. vaginalis. Además, este estudio demuestra que el conocimiento indígena es una fuente importante de nuevos prototipos de agentes antiprotozoarios.
1. Introducción
Trichomonas vaginalis parasita el tracto urogenital humano causando tricomonosis, la enfermedad de transmisión sexual no viral más prevalente a nivel mundial, siendo responsable de 248 millones de nuevos casos anuales ., Después de la colonización, el parásito causa vaginitis, uretritis y prostatitis . Además, el patógeno se ha asociado con graves consecuencias como resultados adversos del embarazo y el parto prematuro, infertilidad , predisposición al cáncer de cuello uterino y enfermedad inflamatoria pélvica . Es importante destacar que la tricomonosis actúa como cofactor en la transmisión y adquisición del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). A pesar del impacto de esta infección, el arsenal terapéutico es restrictivo, y solo metronidazol y tinidazol, ambos medicamentos 5-nitroimidazol, están aprobados por la FDA para el tratamiento de la tricomonosis ., Aunque la tasa de curación es alta, se puede observar fracaso del tratamiento y la resistencia de los aislados de T. vaginalis es la principal razón del fracaso del tratamiento . En este sentido, es sin duda necesario que la investigación de nuevas alternativas para el tratamiento de la tricomonosis y se puedan seguir dos estrategias: (i) la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas, que es esencial para el desarrollo racional de nuevos agentes antiparasitarios y (ii) la investigación de nuevos anti-T., vaginalis compuestos estructuralmente distintos de los 5-nitroimidazoles y, en consecuencia, actuando por un mecanismo diferente como lo demuestra nuestro grupo .
en este contexto, los productos naturales, especialmente las plantas medicinales, son inconmensurables como una potente fuente de moléculas bioactivas. Desde la antigüedad, la gente utiliza las plantas para tratar enfermedades infecciosas comunes, y algunas de estas medicinas tradicionales todavía están integradas como parte de la cura de diversas patologías . Además, la búsqueda basada en información etnofarmacológica rescata el inmenso conocimiento empírico de la utilización de las plantas ., En este contexto, en relación con el medio ambiente natural y la gran riqueza de recursos genéticos, el Brasil es un país de gran interés para la etnofarmacología .
Los Pueblos indígenas tienen una gran cantidad de información sobre biodiversidad y saben cómo capturar y utilizar los recursos naturales . A pesar del hecho de que varias drogas han sido descubiertas a través de curas tradicionales y conocimiento popular, en Brasil hay 122 grupos étnicos indígenas, pero solo el 30% de ellos fueron investigados con respecto a los aspectos etnobotánicos ., Por lo tanto, el estudio de las plantas utilizadas por la medicina indígena es importante para interconectar la medicina tradicional y el medio ambiente biótico preservando el conocimiento ancestral indígena.
los protozoos parásitos siguen siendo una amenaza importante para la salud humana y animal, y hay pocos medicamentos eficaces para el tratamiento de muchas enfermedades protozoarias. Teniendo en cuenta la etnofarmacología indígena como contribuyente al cribado sistemático de plantas con actividad antiprotozoaria, este estudio evaluó el anti-T., vaginalis actividad de las plantas medicinales más importantes utilizadas en la medicina indígena Mbyá-Guaraní ubicada en el sur de Brasil.
2. Materiales y Métodos
2.1. Condiciones de cultivo del parásito
en este estudio, siete aislados de T., se utilizaron vaginalis: 30236 y 30238 de American Type Culture Collection (ATCC); TV-LACM1, TV-LACM2 y TV-LACM3 (aislados clínicos frescos de pacientes femeninas); TV-LACH1 y TV-LACH2 (aislados clínicos frescos de pacientes masculinos) todos del Laboratório de análisis Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, UFRGS, Brasil (proyecto con aprobación ética por el Comité de investigación ética de la UFRGS, número 18923). Las tricomonadas se cultivaron axénicamente en medio de extracto de levadura-tripticasa-maltosa (TYM) (pH 6.0), suplementado con suero bovino inactivado al 10% e incubado a 37°C.
2.2., Material vegetal
material vegetal fue recolectado de la Tribu Indígena Mbyá-Guaraní ubicada en la Lomba do Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brasil (30°06’47.62″ s y 51°07’37.85″ W), en marzo de 2011. Este pueblo se denomina Tekoá Anhetenguá (en inglés, verdadero pueblo), y 200 personas viven en la zona reunidas en 40 familias. Las mujeres de la aldea tienen el conocimiento de las plantas medicinales utilizadas por toda la población y llevaron a cabo la recolección de especímenes. Se recolectaron diez plantas utilizadas rutinariamente en la medicina indígena para enfermedades infecciosas: hojas de Aloe arborescens Mill., (ICN 173371), partes aéreas de Bidens pilosa L. (ICN 167397), partes aéreas de Rhipsalis baccifera (ICN 167402), cortezas de Luehea divaricata (ICN 167403), raíces de Trichilia sp. (ICN 173126), hojas de Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (ICN 167401), hojas de Coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), hojas de Citrus limonium (ICN 167399), hojas de Citrus reticulata (ICN 173127), y hojas de Verbena sp. (ICN 167394). Los ejemplares del voucher fueron depositados en el herbario de la Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN).
2.3., Preparación de extractos de plantas
Los extractos de plantas frescas fueron preparados de acuerdo con el uso tradicional de los pueblos indígenas por decocción a 60°C durante 60 min . Los extractos acuosos se liofilizaron y la solución de trabajo se preparó a 8.0 mg / mL en agua ultrapura, esterilizada por filtración (0.22 µm)y almacenada a -20°C.
2.4. Ensayo anti-Trichomonas vaginalis
diez extractos acuosos fueron seleccionados in vitro para detectar actividad frente a T. vaginalis. El ensayo se realizó en 96 placas de microtitulación a una concentración final de 4,0 mg / mL en los pocillos., La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó mediante una dilución de ocho veces (4,0–0,031 mg/mL), y la viabilidad de los trofozoitos se determinó mediante un método fluorimétrico . Se realizaron dos controles: un control negativo solo con trofozoitos y un control positivo con metronidazol de 8,0 µM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Los experimentos se realizaron al menos en tres experimentos independientes, por triplicado. Los resultados se expresaron como el porcentaje de trofozoitos viables en comparación con parásitos no tratados.
2.5., Efecto de crecimiento de extractos acuosos
para investigar el efecto de los extractos acuosos activos sobre el crecimiento de T. vaginalis, se realizó una curva de crecimiento cinético utilizando el aislado ATCC 30236. La densidad inicial de parásitos de 2,0 × 105 trofozoitos/mL se incubó con los extractos a valor de CMI en medio TYM. Los trofozoitos se contaron mediante hemocitómetro durante 72 h. los resultados se expresaron como número de trofozoitos (105 / mL)., Para el análisis microscópico, los controles y parásitos tratados se centrifugaron durante 10 min a 2.000 rpm para concentrar los organismos después de 4 h de incubación, y la preparación se observó en microscopio de luz (magnificado ×1.000) por exclusión de colorante azul tripano.
2.6. Ensayo hemolítico
Este ensayo se realizó según el método utilizado por Rocha et al. . El grupo sanguíneo o positivo de voluntarios humanos sanos se recolectó con la solución de Alsever (1 : 1) y se centrifugó a 2,000 rpm durante 5 min. La fracción eritrocitaria se lavó tres veces con PBS 1x (pH 7.,0) y resuspendida para dar una suspensión de eritrocitos al 1% (v/v). Las concentraciones de extractos acuosos se eligieron de acuerdo con la concentración mínima inhibitoria (CIM) determinada en el ensayo de susceptibilidad. Los eritrocitos se incubaron con los extractos a 37 ° C bajo agitación durante 1 h y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 5 min. La absorbancia del sobrenadante se midió a 540 nm. El experimento se realizó por triplicado y se calculó el porcentaje de hemólisis causada por cada muestra analizada en comparación con la actividad hemolítica al 100% de la saponina de Quillaja saponaria .
3., Resultados y discusión
Este estudio evaluó la actividad anti-T. vaginalis de extractos acuosos de 10 plantas medicinales utilizadas en el sistema de Medicina Mbyá-Guaraní. Es importante destacar que entre las plantas probadas, encontramos dos extractos acuosos con una potente actividad anti-T. vaginalis in vitro. Los extractos prometedores son de Verbena sp. y Campomanesia xanthocarpa. El extracto de Verbena sp., a 4,0 mg/mL, demostró la actividad óptima anti-T. vaginalis que induce una citotoxicidad completa (100% de la muerte de los parásitos) en todos los aislados de tricomonas distintos(Figura 1 (a))., El extracto de hojas de Campomanesia xanthocarpa en la misma concentración también mostró una actividad anti-T. vaginalis muy alta, reduciendo la viabilidad del parásito hasta un 96% (Figura 1 (b)).
otros extractos acuosos mostraron una variedad de resultados. El extracto acuoso obtenido de Bidens pilosa abolió totalmente la viabilidad de trofozoitos solo del aislado 30236 (Figura 1 (c)). El extracto de las cortezas de Luehea divaricata indujo una reducción de la viabilidad de T. vaginalis de manera diferente en cada aislado de tricomonadas probado(Figura 1 (d))., Las hojas de Coix lacryma-jobi indujeron, en promedio, un 75% de reducción de viabilidad en aislados de T. vaginalis; sin embargo, para el aislado de TV-LACH2, la reducción fue de solo 40% (Figura 1(e)). Los aislados clínicos frescos de pacientes masculinos (TV-LACH1 y TV-LACH2) presentaron mayor susceptibilidad que los aislados de pacientes femeninos (ATCC y fresh clinical) cuando el extracto radicular de Trichilia sp. fue probado (Figura 1(f)). Los extractos de hojas de Citrus limonium redujeron aproximadamente un 40% la viabilidad de los aislados (Figura 1(g))., Los extractos de Aloe arborescens y Citrus reticulata disminuyeron la viabilidad de 50% de al menos un aislado (Figuras 1(h) y 1(i)), mientras que Rhipsalis baccifera redujo solo 30% la viabilidad de 30236 y TV-LACM2 aislados (Figura 1(j)).
En comparación con los otros extractos los extractos de Verbena sp. y C. xanthocarpa demostró la actividad más prometedora contra T. vaginalis, y se determinó la concentración inhibitoria mínima para el aislado 30236 (Tabla 1).,
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con el fin de investigar el efecto del extracto más activo sobre el crecimiento y la viabilidad del parásito, se realizó una curva de crecimiento cinético. El control presentó el pico de crecimiento clásico después de 24 h de incubación; Sin embargo, los organismos tratados con extractos de Verbena sp. y C., xanthocarpa, después de 4 h de incubación, evocó una abolición completa del crecimiento (Figura 2) y mostró un color azul característico por exclusión del tinte azul tripano que indica muerte celular (Figura 3).
de Cinética de crecimiento de la curva de Trichomonas vaginalis 30236 aislar después del tratamiento con los extractos acuosos de Verbena sp. y Campomanesia xanthocarpa a 4.0 mg / mL. El crecimiento de los trofozoitos fue completamente inhibido por los extractos en 4 horas de incubación., Data represent means ± standard deviation of at least three experiments, all in triplicate.
(a) Control
(b) Verbena sp.
(c) Campomanesia xanthocarpa
(a) Control
(b) Verbena sp.,
(C) Campomanesia xanthocarpa
con el fin De investigar un posible efecto de la C. xanthocarpa y Verbena sp., extractos sobre membrana de parásitos y también para tener datos preliminares sobre citotoxicidad contra células de mamíferos, se llevó a cabo la actividad hemolítica de estos extractos. La Verbena sp. los extractos de C. xanthocarpa se probaron a valores de CMI y demostraron lisis de eritrocitos del 6,5 y 7,6%, respectivamente (Tabla 1). Estos resultados demostraron que ambos extractos, a valores de CMI, no promovieron una actividad hemolítica significativa, lo que indica que el mecanismo de acción responsable de la reducción de la viabilidad del parásito probablemente no involucra la alteración de la membrana parasitaria., Además, estos hallazgos sugieren que ambos extractos no son tóxicos para las células de mamíferos, ya que no lisaron eritrocitos humanos.
Este estudio contribuye al rescate del conocimiento indígena sobre plantas medicinales. Los Indígenas Mbyá-Guaraní usan Verbena sp. (Guachu ka’a en idioma Mbyá-Guaraní), como té, para el alivio de los síntomas de enfermedades infecciosas, como la fiebre. Esto está de acuerdo con la literatura que relata Verbena sp. infusión como sedante, analgésico para trastornos inflamatorios, quemaduras de la piel, amenorrea, depresión y enfermedades gástricas ., Además, esta especie tiene una variedad de constituyentes químicos, como flavonoides, glucósidos iridoides, glucósido fenilpropanoide, esteroles, triterpenos y glicoconjugados, y la actividad biológica puede atribuirse parcialmente a ellos . Además, esta tribu utiliza las hojas de C. xanthocarpa (Guavira en idioma Mbyá-Guaraní) para el tratamiento de la diarrea, el dolor de estómago y los gusanos., Esta planta se utiliza tradicionalmente en el sur de Brasil como depurativo, Antidiarreico, limpiador y antirreumático , y para disminuir el colesterol sanguíneo, y estas propiedades pueden atribuirse a los taninos, saponinas y flavonoides (quercetina, miricetina, quercitrina y rutina), compuestos presentes en las hojas de C. xanthocarpa .
la etnofarmacología de rescate de los usos históricos de las plantas es reconocida como valiosa para la bioprospección, ya que proporcionan la justificación para la selección e investigación de plantas medicinales ., Este estudio describe el primer informe sobre la actividad antiprotozoaria de Verbena sp. and C. xanthocarpa. Además, otras especies de las familias Verbenaceae y Myrtaceae fueron probadas contra T. vaginalis, sin embargo, sin éxito . Varias biodiversidades y conocimientos tradicionales de diferentes poblaciones han guiado estudios para buscar nuevos prototipos anti-T. vaginalis. Recientemente, se reportó el potencial de las plantas tradicionalmente utilizadas de Caatinga contra T. vaginalis . Calzada et al., se demostró que las plantas utilizadas para los trastornos del tracto urogenital en la medicina tradicional mexicana mostraron efecto contra este protozoo. Las especies de Amaryllidaceae utilizadas contra enfermedades venéreas en Sudáfrica también mostraron una actividad prometedora contra T. vaginalis .
considerando el impacto de la tricomonosis en la salud pública y el número emergente de aislados resistentes de T. vaginalis, es necesario alternativas para el tratamiento de esta infección. Los productos naturales son una fuente prometedora de moléculas activas, y el enfoque etnofarmacológico rescata el conocimiento de la población de plantas medicinales., Esta sabiduría combinada con los estudios químicos y farmacológicos presenta un valor precioso en la bioprospección de medicamentos innovadores, seguros y accesibles. Este estudio pionero demostró resultados relevantes sobre la actividad anti-T. vaginalis de la Verbena sp. y C. xanthocarpa, plantas tradicionalmente utilizadas por la población indígena Mbyá-Guaraní para enfermedades infecciosas. A pesar de mostrar una fuerte actividad anti-T. vaginalis, este informe rescató el conocimiento de los pueblos indígenas, evitando el aborto de esta sabiduría.,
la contribución de los autores
Clara Lia Costa Brandelli y Patrícia de Brum Vieira contribuyeron igualmente a este trabajo.
agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el programa NANOBIOTEC-Brasil de CAPES y FAPERGS. Los autores agradecen al cacique José Cirilo Pires Morinico (tribu Mbyá-Guaraní), por hacer posible la realización de este estudio y por la valiosa información. Alexandre José Macedo y Tiana Tasca agradecen al CNPq las becas de investigación.
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