resumen
propósito. La Sarcoidosis es una enfermedad granulomatosa sistémica de etiología desconocida. Se han reportado muchas presentaciones clínicas, y la enfermedad aguda debe distinguirse de la enfermedad subaguda y crónica. El curso clínico impredecible de la enfermedad nos llevó a evaluar la utilidad clínica de la detección de biomarcadores en suero en el seguimiento de la sarcoidosis. Método., Las concentraciones séricas de chitotriosidasa, ECA, KL-6 y lisozima se analizaron por diferentes métodos en una población de 74 pacientes con sarcoidosis (46 en terapia con esteroides en el muestreo) monitoreados regularmente en el Centro Regional de Referencia de Sarcoidosis de Siena y en un grupo de controles con el objetivo de comparar su contribución al manejo clínico de los pacientes con sarcoidosis. Resultado., Las concentraciones de KL – 6 fueron significativamente elevadas en los pacientes con sarcoidosis y fibrosis pulmonar y se correlacionaron significativamente con la DLco y la puntuación del IPC, mientras que la chitotriosidasa fue significativamente mayor en los pacientes con localizaciones extrapulmonares. Con un valor de corte de 303,5 UI/ml, KL-6 mostró la mejor sensibilidad (78%), mientras que la chitotriosidasa reportó la mejor especificidad (85%) entre los biomarcadores. Conclusion. KL – 6 es un biomarcador confiable de la afectación pulmonar fibrótica en pacientes con sarcoidosis., Entre los biomarcadores, el KL – 6 mostró la mejor sensibilidad y la chitotriosidasa sérica la mejor especificidad, incluso en pacientes en terapia crónica con esteroides, y pareció correlacionarse con localizaciones extrapulmonares.
1. Introducción
la Sarcoidosis es una enfermedad granulomatosa sistémica asociada a la activación y migración de linfocitos T y macrófagos hacia los órganos afectados. La interacción entre antígenos y APC polariza los linfocitos T al fenotipo T helper 1 (Th1), lo que lleva a la formación de granulomas sarcoides que consisten en células T, macrófagos y células epitelioides y gigantes ., El curso de la sarcoidosis es impredecible: la remisión ocurre en la mayoría de los casos, mientras que la inflamación persistente del granuloma puede conducir a la enfermedad pulmonar fibrótica . Por lo tanto, se necesitan biomarcadores específicos con buena sensibilidad y especificidad para predecir el resultado clínico y guiar las decisiones clínicas.
La chitotriosidasa humana es un biomarcador secretado por macrófagos y neutrófilos activados. Aunque su papel fisiológico no está claro, puede desempeñar un papel en la hidrólisis y degradación de la quitina y sustratos similares a la quitina ., Se han notificado concentraciones elevadas de chitotriosidasa en suero y LBA de pacientes con sarcoidosis activa . La chitotriosidasa muestra una correlación con los estadios radiológicos. Puede predecir el curso clínico, la respuesta a los esteroides y las posibles recaídas de la enfermedad . Sin embargo, no está claro si la chitotriosidasa es confiable en el manejo de pacientes con sarcoidosis con afectación de órganos extrapulmonares.
la enzima convertidora de angiotensina (ECA) es una glucoproteína ácida que convierte la angiotensina I en angiotensina II., Es producida por células endoteliales pulmonares, principalmente macrófagos alveolares activados . Se encuentra elevada en suero y LBA de pacientes con sarcoidosis y sus concentraciones se correlacionan con estadios radiológicos . Sin embargo, su utilidad como herramienta diagnóstica y pronóstica está limitada por su baja sensibilidad y especificidad. La ECA puede estar elevada en ciertos trastornos granulomatosos (incluyendo beriliosis y silicosis), hipertiroidismo, diabetes y otras enfermedades .
la lisozima es producida por el sistema monocito-macrófago y las células epitelioides involucradas en la formación de granulomas pueden liberar esta enzima., Los pacientes con Sarcoidosis muestran un aumento de la concentración de lisozima al inicio. La lisozima se considera más como un indicador pronóstico que como una herramienta de diagnóstico. Tiene una especificidad baja siendo elevada en enfermedades pulmonares como la tuberculosis y la neumoconiosis .
Krebs von den Lungen – 6 (KL-6) es una proteína de mucina MUC1 humana de alto peso molecular derivada de AEC. Sus concentraciones séricas son elevadas en varias ILDs, incluyendo fibrosis pulmonar idiopática y sarcoidosis ., En sarcoidosis, el KL – 6 se correlaciona con la actividad de la ECA: se incrementa principalmente en pacientes en estadios 2 y 3 con evidencia centellográfica de acumulación pulmonar positiva . Los altos niveles de KL-6 sérico en sarcoidosis reflejan la producción de KL-6 derivado de neumocitos de tipo 2 dañados o regeneradores .
en este estudio, comparamos los niveles séricos de diferentes biomarcadores en una cohorte de pacientes con sarcoidosis crónica buscando correlaciones con fenotipos específicos, presentación clínica y localizaciones.
2. Materiales y Métodos
2.1., Población del estudio
Se reclutaron retrospectivamente 74 pacientes con sarcoidosis (27 varones (36,5%), con una edad media de años) controlados regularmente en el Centro Regional de Referencia de Siena para Sarcoidosis e ILDs. Todos los pacientes fueron diagnosticados según los criterios internacionales ATS/ERS/WASOG. Todos habían estado en seguimiento en nuestro centro durante más de 2 años desde el diagnóstico y presentaban una enfermedad crónica persistente. Los criterios de exclusión incluyeron pacientes con síndrome de Lofgren, inicio agudo de la enfermedad, resolución espontánea o seguimiento de menos de 2 años.,
se realizó muestreo sérico en el momento de la inscripción: en el mismo día se realizó prueba de función pulmonar (TFP) y radiografía de tórax, con estadificación radiológica según criterios de Scadding. La clasificación radiológica se vinculó a la detección de la muestra de manera estándar de acuerdo con criterios ampliamente aceptados: estadio 0, normal; estadio 1, adenopatía hilar bilateral sin compromiso parenquimatoso; estadio 2, adenopatía bilateral e infiltración parenquimatosa; estadio 3, infiltración parenquimatosa; y Estadio 4, fibrosis pulmonar asociada a sarcoidosis., Todos los pacientes se sometieron a una tomografía computarizada de tórax de alta resolución (TCAR) para verificar la presencia de fibrosis pulmonar. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado para el estudio, aprobado por el Comité de Ética Local. Para encontrar un valor de corte de KL-6 sérico en nuestra población, recolectamos muestras de suero de 25 voluntarios sanos (6 hombres, Edad Media años), sin antecedentes de enfermedades respiratorias y sin tomar ningún medicamento
2.2., Pruebas de función pulmonar
se realizaron las siguientes mediciones de la función pulmonar según los parámetros estándar ATS / ERS, utilizando un pletismógrafo corporal Jaeger con correcciones de temperatura y presión barométrica: volumen espiratorio forzado en el primer segundo (FEV1), capacidad vital forzada (FVC) y monóxido de carbono pulmonar difuso (DLCO). Todos los parámetros se expresaron como porcentajes de los valores predichos .
2.3., Fenotipado clínico
Los pacientes se clasificaron sobre la base de la afectación pulmonar radiológica y las localizaciones de sarcoidosis, de acuerdo con la relación genotipo-fenotipo reciente en el documento de Sarcoidosis (GenPhenReSa) , así como la puntuación del índice fisiológico compuesto (IPC). Se calculó el IPC en cada paciente de acuerdo con la siguiente fórmula, como se describió anteriormente: 91 – (DLCO predicho) – (FVC predicho)+.,
las localizaciones extrapulmonares de la enfermedad se evaluaron mediante vías diagnósticas específicas de órganos: las afectaciones del hígado, el bazo, el hueso, la médula ósea, los ganglios linfáticos extratorácicos y la piel se probaron mediante biopsia, mientras que la localización cardíaca se evaluó con imágenes de RM.
2.4. Ensayo de chitotriosidasa
la actividad de la Chitotriosidasa se determinó mediante un método fluorimétrico utilizando 22 µM 4-metilumbeliferil β-D-n,N, n-triacetilchitotriosidasa (Sigma Chemical Co.) en tampón citrato-fosfato, pH 5,2; sustrato de 100 µl se incubó durante 1 h a 37 ° C y la reacción se detuvo con 1,4 ml 0.,1 m tampón glicina-NaOH, pH 10,8. La fluorescencia se leyó a 450 nm con un fluorímetro PerkinElmer Victor X4 (longitud de onda de excitación 365 nm). La actividad sérica de la chitotriosidasa se expresó en nmol / ml / h. los valores de normalidad se calcularon de acuerdo con nuestros estudios previos .
2.5. La actividad de la ECA se midió utilizando un método colorimétrico (FAR srl, Verona, Italia) para la determinación de la actividad de la ECA en suero. El rango normal de las concentraciones de ECA fue de 30-80 UI / l .
2.6. Ensayo de lisozima
2.7., Krebs von den Lungen-6 Assay
suero KL – 6 fue medido por NANOPIA® KL-6 reagents assay (Sekisui Diagnostics, UK). El principio del ensayo es la aglutinación del antígeno carbohidrato sialilado en muestras con anticuerpo monoclonal KL-6 a través de la reacción antígeno-anticuerpo. El cambio en la absorbancia se mide para determinar los niveles séricos de KL – 6. Las concentraciones de KL-6 se expresan en UI / ml.
2.8. Análisis estadístico
los datos fueron expresados como . Las comparaciones entre los grupos se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney y la prueba de Kruskal-Wallis con el valor de significancia establecido en ., Se utilizó la prueba de Spearman para buscar correlaciones entre variables. El análisis estadístico y las curvas ROC se realizaron con el software Statistica V 7.0; las representaciones gráficas de los datos se realizaron con el software GraphPad Prism 4.0.
3. Resultados
3.1. Los parámetros clínicos, radiológicos y funcionales
Las características demográficas, los valores de la prueba de función pulmonar y los estadios radiológicos de la población se describen en la tabla 1. Como era de esperar, el inicio se produjo principalmente en la 5ª década (años), prevalente en mujeres que nunca fumaron., En cuanto a la historia clínica, 46 pacientes (62%, 17 varones) estaban en tratamiento con esteroides en el momento de la toma de muestras séricas, con una dosis media de prednisona. De estos, todos menos uno estaban tomando esteroides orales durante más de un año. 13 pacientes (3 varones) estaban tomando fármacos inmunosupresores en combinación con esteroides orales (12 con metotrexato, 1 con azatioprina). Entre los subgrupos libres de esteroides (28 pacientes, 10 hombres), solo dos pacientes nunca habían recibido tratamiento específico para la sarcoidosis.,
en nuestra población, los parámetros de la TFP se encontraban en el rango normal sin alteración significativa de los volúmenes pulmonares: 63 pacientes lograron realizar una maniobra aceptable para DLCO que estaba ligeramente deteriorada, en promedio.
3.2. Se calculó la comparación de los biomarcadores
concentración sérica de KL-6 en todos los pacientes y voluntarios sanos; se detectaron ECA y lisozima en el suero de todos los pacientes. Seis pacientes con actividad chitotriosidasa < 10 nmol / ml / h se sospechó que tenían polimorfismo CHIT1 y fueron excluidos del análisis.,
no se encontraron diferencias significativas en los niveles de biomarcadores entre los pacientes tratados con esteroides y los tratados con esteroides y terapia inmunosupresora.
KL-6 se correlacionó significativamente con la ECA (; ), la lisozima (;) y la actividad de la chitotriosidasa (; ) (Figura 1).,
(a)
(b)
(c)
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(b)
(c)
3.3. Organ Involvement and Phenotypes
The percentage of sarcoidosis patients showing extrapulmonary involvement was 43.2%., Las localizaciones extrapulmonares más frecuentes fueron la piel (16 pacientes, 21,6%), el bazo (11 pacientes, 14,8%) y el hígado (5 pacientes, 6,7%). Las localizaciones menos frecuentes fueron los ojos (3 Pacientes, 4% de los casos) y los ganglios linfáticos extratorácicos (3 Pacientes, 4%); el SNC (2 pacientes, 2,7% de los casos) y el compromiso cardíaco, óseo o de la médula ósea (1,3% de los casos). Sarcoidosis los pacientes con afectación extrapulmonar tuvieron una actividad de la chitotriosidasa significativamente mayor que aquellos con enfermedad pulmonar limitada (;) (Figura 3). No se observaron otras diferencias significativas en relación con la localización de órganos.,
en relación con los fenotipos GenPhenReSa, los pacientes con afectación abdominal () mostraron una actividad de la chitotriosidasa significativamente mayor que aquellos con afectación ocular-cardíaca-cutánea-Central (OCCC) (), musculoesquelética-cutánea () y pulmonar aislada () (, respectivamente; )., No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de KL-6, ECA y lisozima en estos subgrupos.
de acuerdo con la puntuación radiológica, los pacientes con sarcoidosis fibrótica (estadio 4) mostraron las concentraciones más altas de KL-6 sérico en comparación con los otros estadios radiológicos de la enfermedad () (Figura 4).
4., Discusión
se han propuesto muchos biomarcadores para la sarcoidosis, pero ninguno ha mostrado un valor pronóstico satisfactorio para identificar recaídas bajo terapia o localización de órganos vitales. En este estudio, comparamos diferentes biomarcadores de sarcoidosis. Se seleccionaron pacientes con enfermedad crónica en tratamiento por más de 1 año con datos clínicos y demográficos compatibles con las características generales de la sarcoidosis reportadas en la literatura . Incluimos KL – 6 en la lista de biomarcadores, aunque esta proteína ha sido estudiada en FPI y hay pocos datos disponibles sobre su papel en la sarcoidosis., Nuestro interés por el KL – 6 se relacionó con su correlación reportada con afectación pulmonar fibrótica grave y mala supervivencia . La chitotriosidasa, la ECA y la lisozima mostraron una prevalencia menor en nuestra población que la observada anteriormente, probablemente porque la mayoría de los pacientes estaban en tratamiento sistémico a largo plazo con esteroides y no presentaban signos de enfermedad activa en el momento de la muestra sérica. Por el contrario, KL-6 mostró una buena sensibilidad y especificidad en nuestra población, con un valor de corte de 303,5 UI/ml., Hasta donde sabemos, este es el primer estudio en investigar un valor de corte específico de KL-6 en sarcoidosis crónica versus un grupo de controles sanos; sin embargo, este no fue el objetivo principal del estudio y los datos deben validarse en una cohorte más amplia de pacientes. Nuestros hallazgos confirmaron el valor predictivo de KL-6 para la afectación pulmonar fibrótica y el deterioro funcional en pacientes con EPI sarcoidosis ya reportados por Miyoshi et al., ; sin embargo, nuestro estudio es el primero que muestra una correlación significativa entre un biomarcador sérico, KL-6, y la afectación pulmonar fibrótica pulmonar en pacientes con sarcoidosis, cuantificada por el índice IPC. Además, este hallazgo es confirmado por una correlación significativa con los porcentajes de DLCO, sosteniendo la utilidad potencial de las mediciones de KL-6 para evaluar la gravedad de la sarcoidosis en el manejo clínico de estos pacientes., Estos datos fueron consistentes independientemente del estado del tratamiento, lo que sugiere una activación crónica de los macrófagos que no responde al tratamiento con esteroides, en particular en aquellos pacientes con enfermedad pulmonar fibrótica. No se encontraron diferencias significativas en la expresión de KL-6 entre los fenotipos clínicos y/o localizaciones extrapulmonares, lo que indica que KL-6 puede considerarse confiable solo para la afectación pulmonar de la enfermedad. Se detectaron correlaciones positivas entre los biomarcadores de sarcoidosis, como la ECA, la lisozima, la chitotriosidasa y el KL-6 que, por lo tanto, pueden incluirse en la lista de indicadores pronósticos.,
por otro lado, la chitotriosidasa demostró ser más sensible que la ECA, la lisozima y el KL-6 incluso en pacientes bajo tratamiento sistémico; también parece ser el único biomarcador que puede reflejar compromiso extratorácico, según la reciente Clasificación del fenotipo clínico GenPhenReSa., En particular, su expresión es más pronunciada en pacientes con localizaciones de órganos abdominales (hígado y bazo, en nuestra población), probablemente debido a una sobreexpresión por macrófagos residentes activados; estos datos sugieren que la chitotriosidasa puede ser un marcador confiable de la activación del sistema reticuloendotelial en sarcoidosis, como se informó anteriormente en pacientes con enfermedad de almacenamiento lisosomal . No se dispone de estudios sobre el valor pronóstico de la chitotriosidasa en localizaciones de sarcoidosis esplénica y hepática y esta es una novedad relevante de este estudio., A diferencia de la KL-6, la actividad de la chitotriosidasa parece no estar correlacionada con la gravedad del compromiso pulmonar sarcoide o deterioro funcional, lo que sugiere que diferentes patrones de activación de macrófagos pueden estar presentes en el sistema respiratorio de los pacientes con sarcoidosis e influir en la expresión de los biomarcadores .
en conclusión, los pacientes con sarcoidosis crónica, compromiso extrapulmonar grave o deterioro fibrótico en estadio 4 representan un objetivo importante que requiere la identificación de biomarcadores pronósticos confiables para predecir la recaída de la enfermedad y la respuesta al tratamiento sistémico.,
Con base en estos resultados preliminares, se observaron niveles altos de chitotriosidasa y KL-6 (y no ECA o lsisozima) en pacientes con sarcoidosis crónica, independientemente del tratamiento. La actividad de la chitotriosidasa fue significativamente mayor en pacientes con compromiso multiorgánico, mostrando una confiabilidad prometedora para la evaluación de la sarcoidosis multisistémica. Por el contrario, los niveles de KL-6 se correlacionaron con la afectación pulmonar fibrótica, la puntuación del IPC y los porcentajes reducidos de DLCO sugieren un papel potencial como marcador de la gravedad de la sarcoidosis pulmonar., Curiosamente, estos hallazgos fueron reportados en una población de pacientes con sarcoidosis multiorgánica crónica, incluyendo aquellos en terapia, expandiendo la confiabilidad de la chitotriosidasa y KL-6 también en este entorno.
disponibilidad de los datos
los conjuntos de datos generados y / o analizados durante el estudio actual están disponibles en el autor correspondiente a petición razonable. Los datos están disponibles de Laura Bergantini ([email protected]) y Elena Bargagli ([email protected]) para los investigadores que cumplan los criterios de acceso a datos confidenciales.,
conflictos de intereses
los autores declaran no tener conflictos de intereses.
las contribuciones de los autores
Laura Bergantini y Francesco Bianchi contribuyeron igualmente al estudio.
agradecimientos
El presente trabajo fue realizado en la Universidad de Siena.
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