7.13 F: secuenciación de ADN basada en Sanger Dideoxynucleotides

la secuenciación de Sanger, también conocida como secuenciación de terminación de cadena, se refiere a un método de secuenciación de ADN desarrollado por Frederick Sanger en 1977. Este método se basa en la amplificación del fragmento de ADN a secuenciar por la ADN polimerasa y la incorporación de nucleótidos modificados, específicamente, dideoxinucleótidos (ddNTPs).,

el método clásico de terminación de cadena requiere una plantilla de ADN monocatenario, una imprimación de ADN, una polimerasa de ADN, desoxinucleotidetrifosfatos normales (dNTPs) y nucleótidos modificados (dideoxintps) que terminan el alargamiento de la cadena de ADN. Estos nucleótidos terminales de cadena carecen de un grupo 3 ‘ – OH requerido para la formación de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, causando que la ADN polimerasa cese la extensión del ADN cuando se incorpora un ddNTP. Los ddNTPs pueden marcarse de forma radiactiva o fluorescente para su detección en máquinas de secuenciación automatizada.,La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación separadas, que contienen los cuatro de los desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y la polimerasa de ADN. A cada reacción se añade solo uno de los cuatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP). Después de rondas de extensión de ADN de plantilla de la imprimación Unida, los fragmentos de ADN resultantes se desnaturalizan con calor y se separan por tamaño utilizando electroforesis en gel. Esto se realiza con frecuencia utilizando un gel de poliacrilamida-urea desnaturalizante con cada una de las cuatro reacciones se ejecutan en uno de los cuatro carriles individuales (carriles A, T, G, C)., Las bandas de ADN pueden ser visualizadas por autorradiografía o luz UV y la secuencia de ADN puede ser leída directamente de la película de rayos X o imagen de gel.

Las variaciones técnicas de la secuencia de terminación de cadena incluyen el etiquetado con nucleótidos que contienen fósforo radiactivo para el radiomarcaje, o el uso de una imprimación etiquetada en el extremo 5′ con un tinte fluorescente. La secuenciación de Dye-primer facilita la lectura en un sistema óptico para un análisis y una automatización más rápidos y económicos. El desarrollo posterior por Leroy Hood y sus compañeros de trabajo de ddNTPs y cebadores Etiquetados fluorescentemente sentó las bases para la secuenciación automatizada de ADN de alto rendimiento. Los métodos de terminación en cadena han simplificado enormemente la secuenciación del ADN., Más recientemente, se ha desarrollado la secuenciación de dye-terminator. La secuenciación Dye-terminator utiliza el etiquetado del terminador de cadena ddNTPs, que permite la secuenciación en una sola reacción, en lugar de cuatro reacciones como en el método labelled-primer. En la secuenciación de terminadores de tinte, cada uno de los cuatro terminadores de cadena de dideoxinucleótidos está etiquetado con tintes fluorescentes, cada uno de los cuales emite luz a diferentes longitudes de onda.,

Los instrumentos automatizados de secuenciación de ADN (secuenciadores de ADN) pueden secuenciar hasta 384 muestras de ADN en un solo lote (corrida) en hasta 24 Corridas al día., Los secuenciadores de ADN llevan a cabo electroforesis capilar para la separación de tamaños, la detección y el registro de fluorescencia de tinte, y la salida de datos como cromatogramas de trazas de pico fluorescente. La automatización ha llevado a la secuenciación de genomas enteros.